高效液相色譜儀使用注意事項，你都收藏了嗎？
高效液相色譜儀使用注意事項，你都收藏了嗎？
高效液相色譜儀(HPLC)現(xiàn)已成為有機化學分析的重要手段之一.在使用高效液相色譜儀的過程中，我們需要注意哪些問題呢？氣相色譜儀廠家山東譜析科學儀器有限公司就簡單介紹一下。
一、 使用試管的問題
1、試管的潔凈問題
高效液相色譜分析法是一個很靈敏的分析方法，如果因使用不潔凈的試管，便會影響試驗結(jié)果的準確性。例如，在用甲醇作溶劑來溶解樣品時，所用的小試管是用橡膠塞來做蓋子的，因此，在每次進樣時，都有一個保留時間固定的干擾峰存在，后經(jīng)證實，此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產(chǎn)生，換用玻璃試管后，干擾峰消除。
2、塑料試管的溶解問題
近年來，一次性塑料試管給試驗人員帶來了極大的方便，但是，在使用過程中一定要注意有機溶劑對試管的溶解現(xiàn)象，在利用此種試管提取樣品時，有些有機溶劑(如氯仿等)對管壁有溶解現(xiàn)象，這些被溶解下來的物質(zhì)有時也能在檢測器上產(chǎn)生信號，從而干擾樣品的測定。這時，可用相同的實驗條件先行試驗一下，看看不含被抽提物時，提取液在檢測器上能否產(chǎn)生干擾信號，如確有干擾信號存在，就只能換用耐有機溶劑的玻璃試管了。
3、被測樣品在試管壁上的吸附問題
這個問題也應(yīng)引起注意，否則也會影響測試結(jié)果的準確性，在治療藥物監(jiān)測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被測藥物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，為防止提取中吸附現(xiàn)象的發(fā)生，可采用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑，可有效地防止吸附。
二、 操作進樣閥的問題
目前，在分析型高效液相色譜儀中常用的進樣閥是7725型進樣閥，其內(nèi)部的六通閥結(jié)構(gòu)使進樣操作非常方便，但是，如果使用不當，也會帶來問題。例如，在高效液相色譜法的試驗過程中，有時會有異常色譜峰的出現(xiàn)以及重現(xiàn)性不好的問題，這主要是由于操作方法不當所引起，要想解決此類問題，需從以下幾個方面入手。
1、進樣量的控制
用進樣閥來進樣時，閥內(nèi)的樣品環(huán)是定量的，(一般分析型進樣閥的樣品環(huán)體積為20ul)，由于進樣時，注射到進樣閥內(nèi)的樣品溶液在樣品環(huán)的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此，要想使樣品環(huán)中充滿樣品溶液，從而使用進樣閥來準確地定量，則必須使進樣量大于樣品環(huán)體積的2倍。如果用注射器來控制進樣量，則zui大只能注射樣品環(huán)體積1/2的量，這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導(dǎo)致定量分析的誤差。
2、進樣閥的清潔問題
如果樣品環(huán)中有上次進樣時樣品的殘留，必然會污染下次注射進的樣品，為防止這種現(xiàn)象的發(fā)生，應(yīng)按下列步驟操作：a.進樣閥有2個位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時，以注射器將流動相注入進樣閥內(nèi)清洗幾次，每次用量大約40ul；b.然后將進樣閥板手扳至INJECT位置時，再以流動相清洗幾次，每次用量還是40ul；c.zui后，再將樣品注射到進樣閥里。
按照上述的步驟操作，可以避免由進樣閥引起的污染，從而使干擾峰消除并提高分析結(jié)果的準確性。
3、進樣閥溢流管的堵塞
有時，進樣閥的溢流管會發(fā)生堵塞現(xiàn)象，向進樣閥內(nèi)注射樣品時，注射針推不動。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解樣品的流動相用的是鹽溶液，而其中的鹽在溢流管的排空端口處結(jié)晶所致。此時，可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡，端口處鹽的結(jié)晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次進樣完成之后，用蒸餾水反復(fù)沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發(fā)生。
三、 流動相(MOBLLE PHASE)的問題
甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來配制流動相。高效液相色譜法中常用的試劑zui好是高等級的專用試劑，如色譜純試劑。在要求不太嚴格時，優(yōu)級純甚至分析純的試劑也能用。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純試劑。
1、流動相的過濾
配制好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因為溶液中含有很多肉眼難以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒，如果不把它們?yōu)V除掉，就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器，這樣就堵塞了流動相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時，要換用經(jīng)過濾的流動相，并將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物。
2、流動相的脫氣
流動相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體，否則，這些氣體會使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測器的信號產(chǎn)生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮氣脫氣等。真空脫氣法和氮氣流脫氣法是目前zui常用的脫氣法。水和甲醇混合后會產(chǎn)生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會進入色譜柱和檢測器，并將影響分析工作的正常進行。
四、 色譜柱的使用和保養(yǎng)
色譜柱是高效液相色譜儀zui主要的部件，被測物質(zhì)能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長色譜柱的使用壽命。
1、使用預(yù)柱和保護柱
預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進樣器之間，它給色譜柱中的流動相提供了完全的平衡，并防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進入色譜柱。保護柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進入色譜柱，保護柱應(yīng)與色譜柱的填料相同。預(yù)柱和保護柱可以經(jīng)常更換，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長了色譜柱的使用壽命。
2、防止氣體進入色譜柱
些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室。因此，為了防止氣泡進入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動相，并且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進入；c.如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經(jīng)進去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內(nèi)的空氣排除。zui好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導(dǎo)致柱性能的降低；d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進不到色譜柱里面了。
3、色譜柱的清洗
為了不使被測物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之后，都應(yīng)及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應(yīng)先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽，然后再用合適的溶劑來沖洗。
凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之后當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續(xù)操作，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但zui好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。
4、色譜柱的存放
果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點：
a.幾天之內(nèi)的短期放置，應(yīng)先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。
b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應(yīng)使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內(nèi)如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應(yīng)用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由于溶劑揮發(fā)而造成的柱填料干縮現(xiàn)象，因這可導(dǎo)致柱效的嚴重降低。
c.色譜柱應(yīng)貯存在室溫下，如果放置于0℃以下的環(huán)境里，柱內(nèi)就會結(jié)冰，這也將導(dǎo)致柱效的降低。
05 色譜峰的雙峰問題
期使用后的色譜柱，如果有雜質(zhì)進入，就會使色譜柱入口處的固定相“板結(jié)”并在流動相所產(chǎn)生的高壓作用下，形成柱頭的塌陷，被分析的樣品組分的正常色譜峰就變成了雙峰，這時可按下述方法來修復(fù)色譜柱。首先將柱頭的緊固螺母旋下，這時就會發(fā)現(xiàn)柱頭內(nèi)的固定相已被壓縮進去了，嚴重時可縮進10mm以上。在這種情況下，我們可用針尖將流動相表層板結(jié)變黃的部分摳掉，并以相同的固定相將此塌陷區(qū)填平、壓實，再將色譜柱的緊固螺絲上緊，修復(fù)工作即告結(jié)束。用經(jīng)過修復(fù)后的色譜柱再做樣品時，色譜峰就恢復(fù)正常了。
以上從幾個方面簡介了色譜儀的正確使用及故障排除方法。在日常工作中，如果能對這些事項認真對待，做到有問題及時解決，則會大大延長儀器的正常使用期限，并使儀器的性能得到zui大限度的發(fā)揮。
