液相色譜法是一種以液體為流動(dòng)相的色譜法，高效液相色譜法是現(xiàn)在應(yīng)用十分廣泛的一種液相色譜法，這種方法是20世紀(jì)60年代興起的，經(jīng)過(guò)不斷的完善和發(fā)展，現(xiàn)已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)藥分析領(lǐng)域，液相檢驗(yàn)的應(yīng)用已經(jīng)普及，而高效液相色譜法作為液相檢驗(yàn)中的一種重要手段，也得到了大力的推廣與應(yīng)用，目前實(shí)驗(yàn)室最常用的P230高效液相色譜儀。

　　高效液相色譜法及其系統(tǒng)構(gòu)造

　　高效液相色譜法是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，通過(guò)引入氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。區(qū)別于經(jīng)典液相色譜法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，高效液相色譜法采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器等技術(shù)，因此其檢測(cè)有高壓、高速、高效、高靈敏度、檢驗(yàn)速度快、分辨率高等特點(diǎn)，更適宜于分離、分析熱穩(wěn)定性差、高沸點(diǎn)、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)。

　　HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、溶劑貯存器、檢測(cè)器、檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄器等組成。其中輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器最為關(guān)鍵。制備型HPLC儀有餾分收集裝置。新型HPLC儀增加了微機(jī)控制，可進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。

　　輸液泵性能的好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性，好的輸液泵應(yīng)具備輸出壓力高，流量穩(wěn)定、耐腐蝕，密封性能好，液缸容積小等特點(diǎn)；HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣裝置需要：密封性能好，重復(fù)性好，死體積小，對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響??；色譜柱擔(dān)負(fù)分離作用，是色譜系統(tǒng)的心臟，在選擇色譜柱時(shí)要注意選擇柱效高、選擇性好，分析速度快的色譜柱；檢測(cè)器是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，其要求線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、噪音低和適用范圍廣。

　　高效液相色譜的原理及分類(lèi)

　　高效液相色譜的原理主要依靠分離機(jī)制，其分離方法有多種，相應(yīng)的分離機(jī)制也不同。根據(jù)分離機(jī)制的不同主要有四種基本類(lèi)型色譜法：吸附色譜、分配色譜、分子排阻色譜及離子交換色譜法，其他還有膠束色譜法、化學(xué)鍵合色譜法及親和色譜法等類(lèi)別。在液相檢驗(yàn)中，分離是核心，而色譜是一種分離分析手段。無(wú)論是那種分離方法，其分離原理都是一個(gè)物理過(guò)程，與液相層析的原理相似：將要檢測(cè)分析的化合物通過(guò)進(jìn)樣器放入液相色譜儀，流動(dòng)相攜帶著其流過(guò)色譜柱，由于不同物質(zhì)在固定相上的保留時(shí)間不同出現(xiàn)的峰高或者峰面積定量以及出峰時(shí)間的不同而達(dá)到分離，從而或檢測(cè)藥物中不同成分的含量、或分析藥效，或測(cè)定藥物殘留物雜質(zhì)成分的濃度。

　　藥物含量檢驗(yàn)中高效液相色譜的應(yīng)用

　　藥物含量檢驗(yàn)中定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。高效液相色譜儀可使輸出信號(hào)與樣品量最好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定藥物含量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。

　　例如，示差檢測(cè)法就是用高效液相色譜測(cè)定多糖類(lèi)藥物，用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)高效的陰離子交換柱分離出多糖類(lèi)藥物，這種方法優(yōu)于傳統(tǒng)檢驗(yàn)法，可直接對(duì)低濃度糖作定量分析，不需衍生和樣品處理，在節(jié)約時(shí)間和資金的同時(shí)避免了有毒衍生試劑的使用。在檢驗(yàn)中不同類(lèi)型的糖(如單糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)適用于不同的離子交換柱。

　　藥效檢驗(yàn)中高效液相色譜的應(yīng)用

　　藥物的治療效果取決于人體對(duì)藥物的吸收，與藥物成分及其代謝物在血液中的濃度有關(guān)。隨著現(xiàn)代藥物的選擇性越來(lái)越高，所服用的劑量越來(lái)越低，這就需要提高藥效?，F(xiàn)階段藥效臨床試驗(yàn)中采用人肝組織，選擇高效液相色譜法檢測(cè)藥性藥效，對(duì)混合物中微量組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，可搭配固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。

　　例如，用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)血液中藥物濃度的總量限度。內(nèi)標(biāo)法是高效液相色譜的一種常用測(cè)定方法。首先提取血液，然后根據(jù)規(guī)定的方法配制不含藥物的溶液，注入到高效液相色譜儀中，記錄為色譜圖I，然后再配制含有藥物的溶液，以相同的條件注樣，記錄為色譜圖II。然后將圖I與圖II進(jìn)行比較，則可以通過(guò)雜質(zhì)峰確認(rèn)雜質(zhì)峰的面積，從而達(dá)到檢驗(yàn)的效果。

　　藥物殘留中高效液相色譜的應(yīng)用

　　通常藥物在使用一段時(shí)間后在體內(nèi)產(chǎn)生殘留物會(huì)影響認(rèn)得某些生理功能，也就是人們所說(shuō)的食藥三分毒，如何分析藥物殘留物成分，減少其引起的不必要危害，高效液相色譜法起到了重要的作用。質(zhì)譜儀是完成藥物代謝物毒性鑒定的主要工具，是制藥工業(yè)中毒理學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。

　　今后的醫(yī)藥分析檢驗(yàn)研究中，可以應(yīng)用高效液相色譜法不受試樣揮發(fā)性限制等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合其它的先進(jìn)技術(shù)，如色譜——光譜聯(lián)用、柱切換技術(shù)、傅立葉變換紅外線吸收光譜聯(lián)用等，不斷提高高效液相色譜在液相檢驗(yàn)中的應(yīng)用。