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SEC 分析、糖譜分析、氨基酸分析、滴度測定、電荷異構體、多肽藥物分析，最實用的實驗操作寶典都在這里啦。

SEC 分析部分

Q1 ：一定要做 SEC 分析嘛？

A： 聚集體含量影響藥物的安全性與有效性。聚集體分析是CQA分析中非常重要的項目。聚集體分析主要使用SEC手段。

Q2：SEC 分析如果不能夠選擇合適的色譜柱和流動相會遇到哪些問題？

A：主要的四個問題：分離度、回收率、準確度、色譜柱的使用壽命。任何一個考察項不夠好，那這個方法的整體重現性不會好，色譜柱的批次重現性會反影響實驗結果。通常建議進樣體積不大于色譜柱體積的5%。

Q3：SEC 分析實驗操作都要注意哪些關鍵細節？

A: 使用不會影響樣品的流動相，首先考慮使用 150 mm 磷鹽酸緩沖液（ pH 7.0 ）進行分析，高通量分析可以選擇 150 mm 色譜柱長，如果需要提升液相色譜儀分離度，可以選擇兩個色譜柱串聯，SEC 需要小進樣量以保證分離度，通常建議進樣體積不打一色譜柱體積的 5%，色譜柱使用壓力控制在小于 200bar，流速的建議范圍是 0.6-0.8ml/min 的流蘇范圍，但是需要考慮分離時間。

關于糖譜分析

Q1：為什么糖基化很重要？

A：因為會影響到藥物的安全性和藥效

Q2：為什么要對多糖進行標記？

A：引入紫外或熒光的發色基團，提升多糖的分離度，如果不標記峰會裂分，最后是為了增加質譜的靈敏度。

Q3：切糖后凈化需要幾步？

A：親水 SPE 的原理，把小柱用高比例的乙腈去平衡，注意水相的比例不要太高，之后上樣，然后用 96% 乙腈來清洗三次把其他雜質去掉，最后洗脫的時候用 1% 甲酸在水相中洗脫，最后一步需要低溫干燥，通常這一步需要過夜。

Q4：有必要做兩次的凈化嘛？

A：很多人在做了第一次凈化之后不做最終的凈化步驟，這樣會在上液相的溶液中會有比較高的 2-AB 殘留，可能影響到最初的流出，所以對結果是可能產生影響的。

Q5：重現性不好是 HILIC 通病？如何優化？

A：至少運行 5-10倍 以上的柱體積進行再平衡，只要有充分平衡的時間，重現性的問題可以得到優化。

Q6：糖譜分析中會遇到靈敏度不好的問題，怎么辦？

A：建議大家如果使用安捷倫的 FLD EX，建議大家設置激發波長設置為 260 納米，發射波長為 430 納米的設置。

Q7：對于采樣頻率的設置有什么建議嘛？

A：建議大家對二十分鐘的采樣頻度至少放置到 5 Hz 左右，以防色譜峰偏胖和塔板數過高，但是不能一味的提升 Data rate，需要根據這貞的平均峰寬而定。但是不能一味提升 Data rate，較高的 Data rate 也會伴隨較高的基線噪音波動。需要考慮實驗的平均峰寬和信噪比。

Q8：如何實現希望提升靈敏度但又不提升進樣體積？

A：建議是換一個弱一些的 HILIC 溶劑，這樣可以讓峰型比較理想。

氨基酸分析

Q1：為什么要做氨基酸分析？

A：氨基酸是蛋白質的基本組成單元，所以測定氨基酸有重要意義。蛋白與多肽的鑒定和定量是必須做的，FDA 有法規要求做氨基酸，能夠有效監控細胞培養基成分及代謝中間產物。

Q2：氨基酸分析中有哪些建議及注意事項呢？

A: 建議每天都更換新的衍生試劑以及 buffer 以及氨基酸標樣，這樣可能讓人覺得很浪費。我們建議在收到新鮮的試劑盒之后先把衍生試劑和標樣之后小體積分裝，然后凍存就可以有效的避免浪費。建議每天校正保留時間及相應。定期檢查分析柱及預柱的性能。建議每兩天更換新鮮的液相色譜儀流動相。如果壓力升高建議首先考慮更換預柱，預柱就是起到保護分析柱的作用的。

滴度測定與電荷異構體分析

Q1：滴度測定如何獲取更準確的定量結果？

A：使用適當的 Data rate，可以有效提升峰高及靈敏度。當 Data rate 不斷升高的時候，峰高也明顯增高，如果希望方法獲得更好的靈敏度，就適當提升 Data rate，推薦至少放到 10 Hz，盡管做了高波長設置，但是基線從100% A 相到 100% B 相依然會出現擾動，B 相使用 0.5M 乙酸做流動相，很容易配，做低濃度標曲測定非常有必要做空白扣除的工作，以此獲取更準確的定量結果。

Q2：IEX 注意事項：

A：確保系統有足夠的惰性，這會對結果的穩定性有很大的影響，推薦Agilent 1260 Infinity或者采用全新的毛細管流路連接設計來優化這個問題，不同起始鹽濃度對分離結果，鹽濃度越高系統越快；流動相pH值越低，結合力會越強，洗脫會更費力一些。

Q3：cIEF 與 IEX 哪個更好些？對應性如何？

A：cIEF 的分辨率高于 IEX 一個數量級，但是 IEX 可以做制備，對于酸峰堿峰的認定的進一步鑒定方面IEX更有優勢。cIEF 和 IEX 的對應性，往往沒有辦法達到預期，IEX 的酸堿峰分離有時候會不太理想，這是因為 IEX 時僅僅是表面電荷起作用。

多肽類藥物分析

Q1：利用色譜做多肽類藥物分析主要的影響因素有哪些？

A：主要的要素有：化合物/樣品性質（酸堿性、極性、樣品基質、PI 值）、流動相（緩沖鹽、PH、兩相比例、有機相種類、分離模式）、固定相（ pH 耐受性、選擇性、作用機理，其他固定參數）、儀器系統（選擇 HPLC 還是 UHPLC ）、柱外效應、柱溫。

Q2：多肽類藥物分析的核心指標是什么？

A：分離度是需要關注的核心指標。影響分離度的三個參數分別為：塔板數；保留因子，選擇性。塔板數與保留因子越大，分離度越好。而不同的選擇性（主要來自于鍵合相和流動相兩方面）可能對分離結果產生顯著影響。

Q3：那么反相色譜分離度最重要的影響因素有哪些？有什么建議嘛？

A：反相色譜獲得滿意的分離度最重要的三個要素：一根塔板數足夠高的色譜柱，合適的流動相及優化的梯度（選擇流動相時不要用 TFA 體系，水相選擇納鹽而不是鉀鹽或銨鹽，初始濃度建議首先嘗試 50mM。有機相選擇乙腈而不是甲醇，水相 pH 初始建議在主成分 pl+-1.0 附近，使用 buffer advisor 獲得穩定重現的流動相配制），優化的液相色譜儀管路（接頭）及檢測器參數。