譜析分享：新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室儀器檢測(cè)技術(shù)指南

為指導(dǎo)各級(jí)疾控部門(mén)和其他相關(guān)機(jī)構(gòu)開(kāi)展新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，特制定本技術(shù)指南。本指南主要介紹目前已經(jīng)比較成熟、易于實(shí)施的核酸檢測(cè)方法。

                           

一、標(biāo)本采集

 

（一）采集對(duì)象。新型冠狀病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者，其他需要進(jìn)行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進(jìn)一步篩查檢測(cè)的環(huán)境或生物材料（如溯源分析）。

 

(二)標(biāo)本采集要求。

 

1.從事新型冠狀病毒檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過(guò)生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。采樣人員專(zhuān)業(yè)防護(hù)裝備（personal protective equipment，PPE）要求：N95口罩、護(hù)目鏡、防護(hù)服、乳膠手套、防水靴套；如果接觸患者血液、體液、分泌物或排泄物時(shí)，戴雙層乳膠手套。

 

2.住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專(zhuān)業(yè)人員指導(dǎo)下采集。

 

3．密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。

 

4．根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的需要，可結(jié)合病程多次采樣。

 

（三）標(biāo)本采集種類(lèi)。每個(gè)病例必須采集急性期呼吸道標(biāo)本和急性期血液標(biāo)本；重癥病例優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本（如支氣管或肺泡灌洗液等），可根據(jù)臨床表現(xiàn)與采樣時(shí)間間隔進(jìn)行采集。

 

其他研究材料依據(jù)設(shè)計(jì)需求采集。

 

標(biāo)本種類(lèi)：

 

1．上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。

 

2．下呼吸道標(biāo)本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。

 

3．血液標(biāo)本：盡量釆集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液。

 

4.血清標(biāo)本：盡量釆集急性期、恢復(fù)期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）釆集，第二份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周釆集。采集量5ml，以空腹血為佳，建議使用真空釆血管。

 

（四）標(biāo)本采集方法。

 

1．咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

 

2．鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。

 

3．鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集器）。

 

4．深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于含3ml采樣液的50ml螺口塑料管中。

 

5．支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液沖洗收集器1次（亦可用小兒導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集）。

 

6．肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過(guò)口或鼻經(jīng)過(guò)咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開(kāi)口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30~50 ml，總量100~250 ml，不應(yīng)超過(guò)300 ml。

 

7．血液標(biāo)本：建議使用含有抗凝劑的真空釆血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，分別收集血漿和血液中細(xì)胞于無(wú)菌螺口塑料管中。

 

8.血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于無(wú)菌螺口塑料管中。

 

9．其他材料：依據(jù)設(shè)計(jì)需求規(guī)范采集。

 

（五）標(biāo)本包裝。標(biāo)本采集后在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全柜內(nèi)分裝。

 

1．所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類(lèi)、姓名及采樣日期。

 

2．將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。

 

（六）標(biāo)本保存。用于病毒分離和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，能在24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存；24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存（如無(wú)-70℃保存條件，則于-20℃冰箱暫存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長(zhǎng)期保存。應(yīng)設(shè)立專(zhuān)庫(kù)或?qū)９駟为?dú)保存標(biāo)本。標(biāo)本運(yùn)送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。

 

（七）標(biāo)本送檢。標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送往實(shí)驗(yàn)室，如果需要長(zhǎng)途運(yùn)輸標(biāo)本，建議采用干冰等制冷方式進(jìn)行保藏。

 

1．上送標(biāo)本：各省（自治區(qū)、直轄市）首例檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性、疑似聚集性病例及聚集性病例的標(biāo)本，上送中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所進(jìn)行檢測(cè)復(fù)核，并附樣本送檢表（見(jiàn)附件）。

 

2．病原體及標(biāo)本運(yùn)輸

 

2.1 國(guó)內(nèi)運(yùn)輸

 

新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運(yùn)輸包裝分類(lèi)屬于A(yíng)類(lèi)，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN2814，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI602分類(lèi)包裝要求；環(huán)境樣本屬于B類(lèi)，對(duì)應(yīng)的聯(lián)合國(guó)編號(hào)為UN3373，包裝符合國(guó)際民航組織文件Doc9284《危險(xiǎn)品航空安全運(yùn)輸技術(shù)細(xì)則》的PI650分類(lèi)包裝要求；通過(guò)其他交通工具運(yùn)輸?shù)目蓞⒄找陨蠘?biāo)準(zhǔn)包裝。

 

新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運(yùn)輸應(yīng)按照《可感染人類(lèi)的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（原衛(wèi)生部令第45號(hào)）辦理《準(zhǔn)運(yùn)證書(shū)》。

 

2.2 國(guó)際運(yùn)輸

 

新型冠狀病毒毒株或樣本在國(guó)際間運(yùn)輸?shù)模瑧?yīng)規(guī)范包裝，按照《出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定》辦理相關(guān)手續(xù)，并滿(mǎn)足相關(guān)國(guó)家和國(guó)際相關(guān)要求。

  

二、新型冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

 

新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒定。任何新型冠狀病毒的檢測(cè)都必須在具備適當(dāng)條件的實(shí)驗(yàn)室由經(jīng)過(guò)相關(guān)技術(shù)安全培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作。本指南中的核酸檢測(cè)方法主要針對(duì)新型冠狀病毒基因組中開(kāi)放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。

 

在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為陽(yáng)性，滿(mǎn)足以下條件：

 

同一份標(biāo)本中新型冠狀病毒2個(gè)靶標(biāo)（ORF1ab、N）特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。

 

陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產(chǎn)生假陰性的因素，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過(guò)早或過(guò)晚；沒(méi)有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑制等。

     

 

三、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸

 

（一）目的。規(guī)范實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確可靠。

 

（二）范圍。適用于實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)新型冠狀病毒核酸。

 

（三）職責(zé)。

 

檢測(cè)人員：負(fù)責(zé)按照本檢測(cè)細(xì)則對(duì)被檢樣本進(jìn)行檢測(cè)。

 

復(fù)核人員：負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)操作是否規(guī)范以及檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)核。

 

部門(mén)負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對(duì)科室綜合管理和檢測(cè)報(bào)告的審核。

 

（四）樣本接收和準(zhǔn)備。核對(duì)被檢樣本姓名、性別、年齡、編號(hào)及檢測(cè)項(xiàng)目等；待檢樣本的狀態(tài)如有異常，需注明；待檢樣本應(yīng)存放于-70℃冰箱保存。

 

（五）檢測(cè)項(xiàng)目。

 

1.新型冠狀病毒核酸測(cè)定（實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法）

 

推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區(qū)域的引物和探針。

 

靶標(biāo)一（ORF1ab）：

 

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

 

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

 

熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

 

靶標(biāo)二（N）：

 

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

 

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

 

熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

 

核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系參考相關(guān)廠(chǎng)家試劑盒說(shuō)明。

 

2.結(jié)果判斷

 

陰性：無(wú)Ct值或Ct值>40。

 

陽(yáng)性：Ct值<37，可報(bào)告為陽(yáng)性。

 

可疑：Ct值在37-40之間，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若Ct值<40，擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。

 

四、病原生物安全實(shí)驗(yàn)活動(dòng)要求

 

根據(jù)目前掌握的新型冠狀病毒的生物學(xué)性狀、傳播特性、致病性、臨床資料等信息，考慮到新型冠狀病毒感染聚集性發(fā)病且有重癥病例，并有死亡病例的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)活動(dòng)暫按照病原微生物危害程度分類(lèi)中第二類(lèi)病原微生物進(jìn)行管理，具體要求如下：

 

（一）病毒培養(yǎng)。指病毒的分離、培養(yǎng)、滴定、中和試驗(yàn)、活病毒及其蛋白純化、病毒凍干以及產(chǎn)生活病毒的重組試驗(yàn)等操作。利用活病毒或其感染細(xì)胞（或細(xì)胞提取物），不經(jīng)滅活進(jìn)行的生化分析、血清學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)等操作視同病毒培養(yǎng)，上述操作應(yīng)在具有開(kāi)展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的生物安全三級(jí)（Biological Safety Level 3,BSL-3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。使用病毒培養(yǎng)物提取核酸時(shí)，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養(yǎng)同等級(jí)別實(shí)驗(yàn)室和防護(hù)條件下進(jìn)行，可靠方法滅活后的病毒培養(yǎng)物，可在BSL-2或BSL-1級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作。

 

（二）動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)

 

指以活病毒感染動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)。應(yīng)在具有開(kāi)展相應(yīng)活動(dòng)資質(zhì)的動(dòng)物（animal）BSL-3（ABSL-3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作。

 

（三）未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作

 

未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進(jìn)行的病毒抗原檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)、生化分析等操作，應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室操作，但個(gè)人防護(hù)裝備參照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的防護(hù)要求。未經(jīng)可靠滅活或固定的人和動(dòng)物組織標(biāo)本因含病毒量較高，其操作的防護(hù)級(jí)別應(yīng)比照病毒培養(yǎng)。

 

（四）滅活材料的操作

 

感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后可在BSL-1實(shí)驗(yàn)室操作。

 

（五）無(wú)感染性材料的操作

 

指針對(duì)確認(rèn)無(wú)感染性的材料的各種操作，包括但不限于無(wú)感染性的病毒DNA或cDNA操作，應(yīng)在BSL-1實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

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